پایان نامه ارشد رشته کشاورزی بررسی پتانسیل ریزازدیادی و باززایی در تعدادی از ارقام زراعی و گونه¬های یکساله یونجه با فرمت ورد و قابل ویرایش تعداد صفحات 68
مقدمه
یونجه(Medicago sativa L.) یکی از مهم‌ترین گیاهان علوفه‌ای برای تغذیه دام می‌باشد که با وسعت کشت جهانی بیش از 40 میلیون هکتار، زراعت آنامروزه بسیار توسعه یافته است(زانگ و همکاران 2010). همزیستی یونجه با باکتری‌های ریزوبیوم همزیست و در نتیجه تثبیت نیتروژن، حفظ ساختار مناسب خاک و اثرات بالقوه این گیاه در مدیریت آفات به عنوان مهم‌ترین گیاه تناوبی، اهمیت آن را در کشاورزی پایدار افزایش داده است(قوامی و همکاران، 1377(. یونجه اتوتتراپلوئید (2n = 4X = 32) و دگرگشن بوده و تنوع ژنتیکی زیادی بین ارقام مختلف آن دیده می‌شود. و به دلیل ظرفیت باززایی خوب درون شیشهای آن برای یک مدت زمان طولانی از اهداف مطالعات ﮊنتیکی و زیست شناسی سلولی- مولکولی بوده است(اینچوا و همکاران، 2005و شائو و همکاران، 2000). جنس Medicago ترکیبی از گونههای چندساله و یکسالهمی‌باشد. یونجههای یکساله در بیش از 250 منطقه جغرافیایی ایران پراکنده هستند که استان آذربایجان غربی یکی از نواحی رویشی آن‌ها است(حیدری شریف آباد و همکاران، 1379). به طور کلی،اگر ژنوتیپهای یونجه مورد بررسی قرار گیرند،امکان یافتن یک ژنوتیپ با قابلیت باززایی خوب در ژرم پلاسم یونجه وجود دارد(اینچوا و همکاران،2005).افزایش کیفیتو میزان تولیدو مقاومت در برابر بیماری‌ها جزء اهداف اصلی برای اصلاح یونجه (.Medicago sativa L) می‌باشد، اما بیشتر دستاوردهادر گذشته بااستفاده از روش‌هایکلاسیک اصلاحی به دست آمده‌اند، نه از تکنیک‌های مهندسی واین به علت عدم وجود پروتوکل باززایی مؤفق برای طیف وسیعی از ژنوتیپ های یونجه می‌باشد(لی و همکاران،2009).اینگیاه دارایسابقهتاریخی طولانی بوده و قدمتآنبهابتدایتاریختمدن می‌رسد (قوامی و همکاران، 1377). احتمالا منشا آن ناحیه‌ی کائوکاسوس (Caucasus) یعنی شمال شرقی ترکیه، ارمنستان و شمال غربی ایران می‌باشد(میکاد و همکاران، 1988). سازگاری یونجه به دامنه‌ی وسیعی از شرایط آب و هوایی سبب شده است که این گیاه در بیش از 40 میلیون هکتار از اراضی دنیا کشت شود (زانگ و همکاران، 2010)،که در این میان آمریکا بیشترین سطح زیر کشت را دارا می‌باشد، بطوریکه آمریکا، اروپای شرقی و آرژانتین به تنهایی %70 مناطق سطح زیر کشت یونجه را به خود اختصاص می‌دهند (ورونسی و همکاران، 2010). در ایران نیز که از خاستگاه‌های اولیه یونجه بشمار می‌رود، این گیاه در 600 هزار هکتار از اراضی کشور کشت می‌شود که از این سطح زیر کشت حدود 3/4 میلیون تن علوفه خشک عاید کشاورزان می‌شود(آمارنامه وزارت جهاد کشاورزی، 1388).
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: کلیات
مقدمه .......................................................................................................................................................................................................................................... 2
1-1- تاریخچه و خصوصیات گیاه شناسی یونجه................................................................................................................................................................3
1-1-1- اهمیت و گیاهشناسی یونجه....................................................................................................................................................................................3
1-1-2- ژنتیک و گروه‌های مختلف یونجه...........................................................................................................................................................................3
1-1-3- انواع یونجه زراعی داخلی.......................................................................................................................................................................................4
1-2- اهمیت کشت بافت..........................................................................................................................................................................................................4
1-3- کشت بافت گیاهی .........................................................................................................................................................................................................5
1- 4- تاریخچه کشت بافت یونجه..........................................................................................................................................................................................7
فصل دوم: بررسی ادبیات موضوع و سابقه تحقیق
2-1- باززایی درون شیشهای................................................................................................................................................................................................ 10
2-1-1- باززایی مستقیم در یونجه.......................................................................................................................................................................................10
2-1-2- باززایی غیرمستقیم در یونجه................................................................................................................................................................................13
فصل سوم: روش تحقیق
3-1- رقم مورداستفاده...........................................................................................................................................................................................................24
3-2- محیط کشت، ترکیبات و آماده سازی آن................................................................................................................................................................24
3-2-1- محلولهای ذخیره مواد معدنی برای تهیه محیط کشتSH .......................................................................................................................34
3-2-2- محلول های ذخیره مواد تنظیم کننده رشد....................................................................................................................................................25
3-3- شرایط کشت، ضد عفونی بذر و کشت ریزنمونهها..................................................................................................................................................26
3-3-1- باززایی مستقیم از گره ساقه.................................................................................................................................................................................26
3-3-2- سازگاری گیاهچهها..................................................................................................................................................................................................28
3-4- باززایی غیرمستقیم ..................................................................................................................................................................................................... 28
3- 5- روش و ابزار گردآوری اطلاعات..................................................................................................................................................................................30
3-6- روش آماری و تجزیه دادهها.........................................................................................................................................................................................30
فصل چهارم: تجزیه و تحلیل اطلاعات
4-1- القاء جوانه و باززایی .....................................................................................................................................................................................................32
4-1-1- القاء جوانه در محیط کشت SIM I......................................................................................................................................................................32
4-1-2- باززایی شاخساره در محیط کشتSIM I...........................................................................................................................................................35
4-1-3- القاء جوانه در محیط کشت SIM II....................................................................................................................................................................37
4-1-4- باززایی شاخساره در محیط کشتSIM II ........................................................................................................................................................40
4-1-5- اثر ژنوتیپهای مختلف یونجه چندساله و یکساله در القاء جوانه و باززایی شاخساره در محیط کشت SIM I....................................43
4-1-5-1- اثر ژنوتیپهای مختلف یونجههای چندساله در القاء جوانه در محیط کشت SIM I...........................................................................43
4-1-5-2- اثر ژنوتیپهای مختلف یونجههای یکساله در القاء جوانه در محیط کشت SIM I..............................................................................43
4-1-5-3- اثر ژنوتیپهای مختلف یونجه چندساله در باززایی شاخساره در محیط کشت SIM I.......................................................................44
4-1-5-4- اثر ژنوتیپهای مختلف یونجه یکساله در باززایی شاخساره در محیط کشت SIM I..........................................................................45
4-1-6- اثر ژنوتیپهای مختلف یونجه چندساله و یکساله در القاء جوانه و باززایی شاخساره در محیط کشتSIM II....................................45
4-1-6-1- اثر ژنوتیپهای مختلف یونجه چندساله در القاء جوانه در محیط کشت SIM II..................................................................................45
4-1-6-2- اثر ژنوتیپهای مختلف یونجه یکساله در القاء جوانه در محیط کشت SIM II.....................................................................................46
4-1-6-3- اثر ژنوتیپهای مختلف یونجه چندساله در باززایی شاخساره در محیط کشت SIM II.....................................................................47
4-1-6-4- اثر ژنوتیپهای مختلف یونجه یکساله در باززایی شاخساره در محیط کشت SIM II.........................................................................47
4-2- ریشهزایی........................................................................................................................................................................................................................48
4-2-1- ایجاد ریشه در یونجههای چندساله......................................................................................................................................................................48
4-2-2- درصد ایجاد ریشه در یونجههای چندساله..........................................................................................................................................................48
4-2-3- درصد ایجاد ریشه در یونجههای یکساله..............................................................................................................................................................50
4-3- سازگاری و انتقال به شرایط گلخانه...........................................................................................................................................................................50
4-4- القاء کالوس در یونجههای چندساله و یکساله.........................................................................................................................................................51
4-4-1- باززایی غیرمستقیم از کالوس یونجه.....................................................................................................................................................................52
فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادات
5-1- یونجههای چندساله.......................................................................................................................................................................................................55
5-1-1- باززایی مستقیم ........................................................................................................................................................................................................55
5-1-1-1- القاء جوانه و باززایی شاخساره تحت تاثیر سطوح مختلف BAP و NAA ..............................................................................................55
5-1-1-2- القاء جوانه و باززایی شاخساره تحت تاثیر TDZ همراه با AgNO3.........................................................................................................56
5-2- یونجههای یکساله..........................................................................................................................................................................................................56
5-2-1- باززایی مستقیم ........................................................................................................................................................................................................56
5-2-1-1- القاء جوانه و باززایی شاخساره تحت تاثیر سطوح مختلف BAP و NAA ..............................................................................................56
5-2-1-2- القاء جوانه و باززایی شاخساره تحت تاثیر TDZ همراه با AgNO3...........................................................................................................57
5-3- باززایی غیر مستقیم در یونجههای چندساله و یکساله..........................................................................................................................................59
5-4- نتیجه گیری و پیشنهادات...........................................................................................................................................................................................60
فهرست منابع و ماخذ.............................................................................................................................................................................................................61
چکیده انگلیسی.......................................................................................................................................................................................................................67
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 3- 1- ترکیب محلولهای ذخیره (50×) پنجگروه نمکی غیر آلی فرمولاسیونSH....................................................................................25
جدول 3-2- ترکیبهای مختلف تنظیمکنندههای رشدی مورد استفاده در محیط کشت پایه MS حاویویتامینهایB5 برای القاء جوانه و باززایی در ارقام و گونه های مختلف یونجه..........................................................................................................................................................................28
جدول 3-3- ترکیبهای مختلف تنظیمکنندههای رشد مورد استفاده در محیط کشت پایه MS حاوی ویتامینهای B5 برای القاء کالوس در ارقام و گونههای مختلف یونجه...............................................................................................................................................................................................29
جدول 3-4- محیط کشتهای مختلف حاوی ترکیبهای مختلف تنظیمکنندههای رشدی مورد استفاده برای رشد کالوس در ارقام و گونههای مختلف یونجه ...................................................................................................................................................................................................................29
جدول 3- 5- ترکیبهای مختلف تنظیمکنندههای رشدی مورد استفاده در محیط کشت پایه MS حاوی ویتامینهای B5 برای باززایی غیر مستقیم در ارقام و گونههای مختلف یونجه.........................................................................................................................................................................29
جدول 4-1- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط کشتهای حاوی سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد جوانههای القاء شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چندساله همدانی، قره یونجه، اردوباد................................................................................................................32
جدول 4-2- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط کشتهای حاوی سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد جوانههای القاء شده در 2 گونه یونجه یکساله M. rigidula و:M.scutellata.......................................................................................................................................34
جدول 4-3- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط کشتهای حاوی سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد شاخسارههای باززا شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چندساله همدانی، قره یونجه، اردوباد.......................................................................................................36
جدول 4-4- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط کشتهای حاوی سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد شاخسارههای باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه یونجه یکساله M. rigidula وM. scutellata....................................................................................................36
جدول 4-5- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط کشتهای حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO3 بر روی صفت میانگین تعداد جوانههای القاء شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چندساله همدانی، قره یونجه، اردوباد..................................................................................38
جدول 4-6- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط کشتهای حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO3 بر روی صفت میانگین تعداد جوانههای القاء شده در هر ریزنمونه در 2 گونه یونجه یکساله M. rigidula وM. scutellata...............................................................................39
جدول 4-7- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط کشتهای حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدونAgNO3 بر روی صفت میانگین تعدادشاخسارههای باززا شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چندساله همدانی، قره یونجه،اردوباد.............................................................................40
جدول 4-8- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط کشتهای حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدونAgNO3بر روی صفت میانگین تعداد شاخسارههای باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه یونجه یکسالهM.rigidula وM.scutellata............................................................................42
جدول 4-9- اثر غلظتهای ترکیب مختلف BAP و NAA برای القاء جوانه در سه رقم یونجه چندساله.............................................................43
جدول 4-10- اثر غلظتهای ترکیب مختلف BAP و NAA برای القاء جوانه در دو گونه یونجه یکساله.............................................................44
جدول4-11- اثر غلظتهای ترکیب مختلف BAP و NAA برای باززایی در سه رقم یونجه چند ساله...............................................................44
جدول 4-12- اثر غلظتهای ترکیب مختلف BAP و NAA برای باززایی در دو گونه یونجه یکساله....................................................................45
جدول 4-13- اثر غلظتهای مختلف TDZبه همراه یا بدون AgNO3برای القاء جوانه در سه رقم یونجه چندساله.......................................46
جدول 4-14- اثر غلظتهای مختلف TDZبه همراه یا بدون AgNO3برای القاء جوانه و باززایی در دو گونه یونجه یکساله.........................46
جدول 4-15- اثر غلظتهای مختلف TDZبه همراه یا بدون AgNO3برای باززایی در سه رقم یونجه چند ساله............................................47
جدول 4-16- اثر غلظتهای مختلف TDZبه همراه یا بدون AgNO3برای باززایی در دو گونه یونجه یکساله.................................................48
جدول 4-17- میزان القاء کالوس در ارقام و گونههای مختلف یونجهتحت تاثیر محیط کشتهای مختلفCIM............................................51
جدول 4-18- وزن کالوسهای رشد یافته در محیط CGM در ارقام چندساله قره یونجه و همدانی..................................................................52
فهرست اشکال
شکل 3-1- ضد عفونی و کشت بذور یونجه جهت تهیه ریزنمونه..................................................................................................................................27
شکل 4-1- مراحل مختلف القاء جوانه، شاخسارهزایی و ریشهزایی در ژنوتیپهای چندساله یونجه......................................................................49
شکل 4-2- مراحل مختلف القاء جوانه، شاخسارهزایی و ریشهزایی در دو گونه یونجه یکساله................................................................................51
شکل 4-3- مراحل مختلف باززایی غیرمستقیم یونجه چندساله....................................................................................................................................53
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 4-1- تاثیر محیط کشتهای SIM I حاوی سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد جوانههای القاء شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چندساله همدانی، قره یونجه، اردوباد.....................................................................................................................................33
نمودار 4-2- تاثیر محیط کشتهایSIM I حاوی سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد جوانههای القاء شده در 2 گونه یونجه یکساله M .rigidula و. M. scutellata...........................................................................................................................................................34
نمودار 4-3- تاثیر محیط کشتهای SIM I حاوی سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد گیاهچههای باززا شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چندساله همدانی، قره یونجه، اردوباد.....................................................................................................................................36
نمودار 4-4- تاثیر محیط کشتهای SIM I حاوی سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد گیاهچههای باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه یونجه یکسالهM .rigidula و. M. scutellata................................................................................................................................37
نمودار 4-5- تاثیر محیط کشتهای SIM II حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO3 بر روی صفت میانگین تعداد جوانههای القاء شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چندساله همدانی، قره یونجه، اردوباد.......................................................................................................38
نمودار 4-6- تاثیر محیط کشتهای SIM II حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO3 بر روی صفت میانگین تعداد جوانههای القاء شده در هر ریزنمونه در 2 گونه یونجه یکسالهM .rigidula و. M. scutellata.................................................................................................40
نمودار 4-7- تاثیر محیط کشتهایSIM II حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO3 بر روی صفت میانگین تعداد گیاهچههای باززا شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چند ساله همدانی، قره یونجه، اردوباد....................................................................................................41
نمودار 4-8- تاثیر محیط کشتهایSIM II حاوی سطوح مختلف TDZ همراه وبدون AgNO3بر روی صفت میانگین تعداد شاخسارههای باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه یونجه یکساله...........................................................................................................................................................42
نمودار 4-9- درصد ایجاد ریشه تحت تاثیر ترکیبات مختلف تنظیم کنندههای رشد (mg/l 5/1 , 1) NAA و (mg/l 5/1 , 1) IBA در سه رقم یونجه همدانی، قره یونجه و اردوباد...............................................................................................................................................................................49
نمودار 4-10- درصد ایجاد ریشه تحت تاثیر ترکیبات مختلف تنظیم کنندههای رشد (mg/l 5/1 , 1) NAA و (mg/l 5/1 , 1) IBA در دو گونه یونجه M. rigidula و M. scutellata........................................................................................................................................................................50
پایان نامه ارشد رشته کشاورزی بررسی پتانسیل ریزازدیادی و باززایی در تعدادی از ارقام زراعی و گونه¬های یکساله یونجه